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股票代码为（300404）创立于2002年，2015年在深圳创业板上市，是一家为海内外医药企业提供药品、保健品、医疗器械研发与生产全流程“一站式”外包效劳(CRO)的型高新技术企业，同也提供药品上市许可持有人(MAH)效劳。
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药品研发“一站式”效劳包括：新药立项研究和活性筛选、药学研究(含中试生产)、药理毒理研究、临床用药与模拟剂的生产、临床试验、临床数据治理和统计剖析、上市后再评价、技
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公司新闻
袁来如此 | 大分子生物剖析概论（十四_上）：LBA定量剖析双特异性生物药的挑战
作者：广州1066VIP威尼斯医药 时间：2021-08-18 来源：广州1066VIP威尼斯医药
     本文为系列文章《大分子生物剖析概论》的第十四篇，旨在凭据已宣布的文献资料，开端的介绍定量剖析双特异性抗体的LBA要领所面临的挑战。
 
     由于内容篇幅较长，本文将接纳上下篇形式进行推送，敬请垂注！《袁来如此》专栏系广州1066VIP威尼斯医药微信民众号打造的科普学术专栏，内容均为1066VIP威尼斯医药药物研究中心资深科学照料袁智博士原创。

 
     与古板（单特异性）的生物药相比，双特异性生物药对其药代动力学（PK）的表征提出了奇特的挑战。在此配景下，开爆发物药的生物剖析战略正在迅速演变，以支持这些不绝变革的药物模式。


     一般说来，生物剖析战略应凭据药物的作用机制（mechanism of action，MOA）和开发阶段定制。关于 mAb 药物，用于剖析药代/毒代动力学（PK/TK），药效动力学和免疫原性的剖析要领通常划分为定量剖析、“游离”和“总”药物浓度、“游离”和“总”靶标浓度、抗药物抗体（ADAs）和中和性 ADAs的开发和验证。关于具有庞大结构的抗体衍生物（antibody derivatives），衍生物的每个功效域可能需要特另外一组检测要领，从而可能导致测试要领的数量几何级增长。


     别的，与开发默认没有生物转化（biotransformation）的mAb相比，庞大的抗体衍生物更容易爆发生物转化，这意味着可能需要另一组测试要领来描述庞大抗体药物的结构完整性及其生物转化后的种种产品（biotransformed variants）。


     配体结合式测试要领（LBA）是mAbs生物剖析的主力军，同时液相色谱-质谱要领（LC-MS）也在近年越来越受接待。这两种剖析技术也主要应用于抗体药物及其衍生物的生物剖析。

 
     由于药物模式的庞大性，通常需要多个 LBA/LC-MS 剖析要领。当每个剖析要领都有特定的取样程序，并且并非所有的检测可以在一个生物剖析实验室实施时，奇特的样本收罗、处理、贮存、运输和剖析条件，会造成庞大的后勤需求。因此，需要设计一种生物剖析战略，用于表征双特异性分子的PK特性，并研究其体内结构-功效关系。本文提供了若干相关案例研究和监管层面的预测。

导论

    近年来，卵白质工程和生产方面的进展推动着生物制药行业开发越来越庞大的卵白质药物，其能够结合多个药物治疗靶标，故能够提高疗效和/或者减少剂量，用以降低毒性，使宁静危害最小化，提高用药的便当性和依从性等。双特异性药物被界说为基于抗体（antibody-based）或基于框架（scaffold-based）的卵白质药物，其包括一个以上的工程革新功效区域，该功效区域结合两个或多个独立的抗原靶点。本文集中关注双特异性药物的两个奇特的功效域，其结合与疾病的爆发和进展相关的卵白质，而不考虑抗体骨（主）干（antibody backbone）的功效。


    开发双特异性生物药的领域，基于并生长了古板的单分子靶点的抗体免疫疗法的框架，正在蓬勃生长，以靶向协同的分子途径（target synergistic molecular pathways）来更有效地治疗疾病。两种双特异性抗体，blinatumomab（Blincyto）和catumaxomab（Removab）已经在美国或欧盟批准上市，用于肿瘤适应症的治疗；这证明了这类药物分子的应用价值。目前有60多种用于癌症和其它疾病的新型双特异性生物药正在临床开发之中。


双特异性生物药分子


     双特异性分子可以以种种差别的结构泛起，利用抗体可用的种种结合域。这些结合域包括可变重链(VH)、可变轻链(VL)、单链分子(ScFv)和/或抗体的Fc域，可以组合使用这些结构域，以结合多个分子靶标。具有多个Fab结合域的双可变域免疫球卵白(dual-variable domain immunoglobulin，DVD -Ig)这样的大型免疫球卵白分子和较小的串联ScFv结构域(diabody)，在分子巨细和结构上代表了两个极端，它们都可通过种种卵白质工程技术生产出来(图1)。

    图1. 双特异性分子的结构。本图展示了三个双特异性抗体的例子：1. Hetero-lg；2.双可变结构域/dual variable domain；3.antibody-peptibody；这些代表了差别的分子巨细，结构及庞大性。

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      目前的技术允许卵白质结合域（protein binding domains）和抗体支架（antibody scaffolding）的多种组合，形成一系列奇特的药物模式（drug modalities）。双特异性药物的几个功效类别包括：与可溶性靶标结合以抑制或刺激相关功效、与细胞靶标结合以拮抗或刺激相关功效、与细胞靶标结合以招募免疫细胞以增进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)功效。


     对双特异性分子奇特的结构和作用机制(MOA)给药代动力学和药理学(PK/PD)评估，体内结构-功效关系简直定以及临床前和临床药物开发阶段所需的生物剖析支持带来了新的挑战。


双特异性抗体

     双特异性抗体是通过基因工程重组生产的抗体，由两个差别的结合域（two distinct binding domains）组成，能够结合两种差别的抗原或同一抗原的两个差别表位。它们可以分为两个主要类别，即带有或缺少Fc区域的两类。关于生物剖析支持， FDA关于双特异性抗体开发的指南指出：可能需要开发多种PK定量要领，以定量总（total），结合（bound）和未结合（unbound）的双特异性抗体的浓度；也可能需要多个免疫原性测试要领，来测试对双特异性抗体差别结构域的免疫反应。

 
 
     由于双特异的性质，双特异性抗体的未结合或“游离”PK定量要领可以包括三个测定要领：一个双功效要领同时测定两个活性结合域（active binding domains）和两个单功效要领划分测定二个结合域中之一。双功效要领划分使用两个靶标卵白作为捕获和检测试剂。单功效要领使用一个靶标卵白作为捕获试剂，而使用抗人类IgG作为检测试剂。通常，在解释检测结果时应谨慎，因为单特异性要领缺乏特异性，故也能检测到双功效分子。


     双特异性抗体的定量PK剖析要领面临生物转化（biotransformation）的重大挑战，因此，通常定制开发要领以定量某个功效域生物转化的水平。奇特的双特异性结构可能造成意外的生物转化路径，并可能使PK行为庞大化。


双特异性生物药的PK/PD


    双特异性分子增加了PK建模的庞大性，例如，表征靶向介导的药物处理需要考虑两个靶点的表达，它们以差别的频率泛起在差别的细胞类型上。“游离”药物浓度与“总”药物浓度的定量，关于PK/PD建模至关重要，特别是当涉及可溶性靶点时；可是，由于靶标卵白在体内的差别表达模式（expression patterns），药物定量剖析可能会变得越发庞大。在绝大大都的临床研究中，药物浓度是在所谓的“中央隔室central compartment”或系统循环（systemic circulation）中，以血浆或血清样本的形式，测定的，这在很洪流平上是由于易于从服用药物的受试者中取样。凭据几十年累积的科学数据，系统药物浓度（systemic drug concentrations）反应了药物在靶标作用部位的浓度。血液病是一个例外，但纵然是血液病也通常含有固体组织的部分。系统药物浓度和作用所在（site-of-action）的药物浓度之间的关系会因作用所在的差别而差别，但适当的动物模型数据通常为人体状况提供了可靠的模型。

 
     由于药理学或药效学响应依赖于全身药物浓度，正确理解PK-PD关系关于预测抵达预期响应的剂量和袒露量极为有用。同样重要的是，确定可能爆发在每个奇特的双特异性分子上的任何潜在的体内生物转化（in vivo biotransformation），并彻底表征差别的药物在袒露量和活性方面的差别。总体来说，这些表征有助于理解药物的袒露量-响应关系，并提供了，基于药物变构体活性，优化剂量设计计划。


    PK评估是非临床毒理学研究和临床开发的一定需求，在非临床疾病模型评估中也发挥着重要作用；一般在非临床疾病模型评估中，研究药物剂量-响应的特性，用以选择先导药物。非临床毒理学研究中的全身袒露量数据，可用于确定首次对人(FIH)研究的宁静起始剂量，该起始剂量是基于此类宁静研究确定的袒露量余量（exposure margin）。袒露量余量由未视察到不良反应水平(NOAEL)的动物袒露量与选定人体剂量的预期袒露量的比值确定，通常设定为比NOAEL预期的人体等效剂量(HED)低10倍。由于双特异性分子可靶向多种生理或病理途径，因而可能具有更强的药理和/或毒理学作用；故监管机构可能要求制药商使用“最低预期生物效应水平”（MABEL）模型来选择FIH剂量,这意味着需要比基于NOAEL更低的起始剂量。临床研究中较低的起始剂量，意味着可能需要提高PK要领的灵敏度；考虑到双特异性分子的庞大性，这可能是一个挑战。

 
PK定量剖析要领

 
    为了支持切合药物预期用途的PK数据的可靠性和有效性，监管机构希望制药商，对所有的GLP研究/要害临床试验，使用经过验证的剖析要领来定量药物浓度。监管部分为生物剖析要领的验证提供了具体的指南，这些指南在全球各监管机构中普遍一致。这些指南文件清楚地剖析了对剖析要领参数的性能及其可接受值的监管期望，包括收集，贮存和剖析历程中研究样本的完整性。关于检测试剂的讨论，特别是捕获和检测试剂的选择，剖析花样和技术平台，以及用于PK表征和PK/PD相关性剖析的相关待测物，都可以在科学文献中找到。关于靶标在血液循环中的药物（这些靶标可在血清或血浆样本中形成药物-靶标复合物），关于应当测定的最相关的药物形式(不包括生物转化物/ biotransformants)仍然保存争议:“总体”(结合了 + 未结合靶标的药物)或“游离部分”或“活性部分”(未结合靶标的部分)。关于总药物浓度和游离药物浓度的问题最好凭据靶标的已知状况，药物的MOA和特征，项目团队的意见，技术可行性，以及监管反�。ㄈ绻枰幕埃�，按个案处理的原则解决。最近有文献讨论了相关问题。


LBA定量要领


   生物剖析战略的选择可以凭据药物特定的开发阶段而有所差别。例如,在非临床物种中研究人类卵白药物, 使用不与非人类物种交叉反应的，针对人类卵白的试剂，特别是非人灵长类同源物，例如,重组人源化单克隆抗体（recombinant humanized monoclonal antibody，rhuMabs）,可以开发一种通用的，快速且经济的PK剖析要领来测定总药物浓度，以支持全面的毒理学评价。然而,这种要领不可用在临床研究中,越发药物特异性试剂，例如，靶标抗体和anti-idiotypic抗体，更可能是须要的：使用通用试剂与内源性分子爆发交叉反应会滋扰卵白药物浓度的定量，而测定游离药物的浓度与建立PK-PD关系息息相关。非临床和临床生物剖析战略的另一个问题是，使用针对每个靶标结合位点（target binding site）的试剂，例如针对每个靶标结合域的靶标和/或anti-idiotypic抗体的组合，来测定完整的双特异性分子是否最有价值。

Anti-idiotypic 抗体

   当一种抗体与另一种抗体的idiotope结适时，它被称为抗idiotope抗体�？固宓目杀洳糠�，包括奇特的抗原结合位点，被称为idiotope。Idiotopes内的表位组合关于每种抗体都是唯一无二的(图2).由于目前开发的大大都单克隆抗体药物是人源的或人源化的，因此最可能诱导抗药物抗体（ADA）的免疫原性表位（immunogenic epitopes），保存于提供大大都结合接触面（binding contacts）的hypervariable complementarity determining regions（CDR）之内�？梢陨煽筰diotypic抗体，特异性地结合一个单克隆抗体药物。这些高度特异性的抗体可用于，以差别测试花样，开发药代动力学（PK）定量要领，以测定临床前和临床样本中的游离药或总药物的浓度，或在ADA测试中作为阳性比照等。

图2. 抗体idiotope：抗体可变区域的，奇特的抗原决定因素（antigenic determinants）的荟萃。

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    在这方面，药物的MOA在选择合适的剖析要领时很重要，特别是在药物活性依赖于双特异性药物对两个靶点的同时作用的情况下�？笴D3/抗肿瘤靶标双特异性药物就是一个例子：测定完整的，有活性的双特异性分子是充分表征该药物的最佳战略。反之，如果药物活性依赖于一个靶点的加入，而另一个靶点的加入只是增强了药物活性, 那么，测定完整药物可能就不那么重要了；此时，只使用一种药物特异性试剂 (例如，单臂靶向/1-arm target，单臂/1-arm延长 PK或增加袒露量) 可能是合理的战略。另一种要领的一个例子是评估catumaxomab抗体的PK: 该PK剖析要领利用了该抗体药物是小鼠/大鼠的嵌合结构体，使用了特异性的antispecies immunoglobulin的捕获/检测试剂。这里，使用了一个针对药物的嵌合结构的混淆通用剖析花样（mixed generic assay format）；该要领特异性来自嵌合结构，而不涉及CDRs。这种要领基于两个假设: 首先，单克隆抗体(mAb)药物在体内通常很是稳定。其次，靶标卵白没有可检测到的可溶性形式。因此，该PK剖析要领可以测定血液循环中游离的catumaxomab单抗，这是切合其预期用途的。一般来说，默认的生物剖析战略是利用双特异性药物的双特异性，但需要认识到开发这样的试剂是耗时的和有挑战的；并且可能在药物发明甚至非临床研究阶段还没有这样的试剂。下面将更详细地考量种种选择。

PK定量要领的设计

完整双特异性分子的剖析要领

 
    完整双特异性分子定量的目的是测定生物基质中完整的双特异性分子。该测试只测定有活性双特异性分子，其没有任何功效区域被抗药物抗体(ADA)或血液循环中的靶点切断（clipped off）或阻断（blocked）。完整分子的检测要领通常需要使用靶标抗体和/或anti-idiotypic抗体，以测定包括可结合捕获和检测试剂这两个功效域的分子。在评估体内或体外稳定性时(假设试剂可用)，建议接纳完整分子的剖析要领。完整分子定量的测试花样如图3A所示。

 
     这种测试花样使用两个靶标分子或两个完全中和性的anti-idiotypic抗体，或两者的组合。最近， LC-MS，结合affinity pull-down（使用靶标或anti-idiotypic抗体）以疏散待测物，已用于表征的生物基质中的药物完整分子。Affinity pull-down是一种类似于免疫沉淀（immunoprecipitation）的小规模亲和纯化技术，只是抗体也可以被其它亲和系统所取代。

 
     这是一种sequential要领：首先，使用anti-idotypic抗体来下拉（pull down）双特异性药物的游离形式；然后，用LC-MS法进行定量。利用这种形式，可以确定双特异性分子的游离浓度。然而，在要领开发历程中需要考虑几个要害因素:

 
     该测试花样必须设计好，以制止潜在的空间位阻效应（steric hindrance）。一些双特异性分子被设计为靶向一个可溶性分子和一个与细胞结合的分子(细胞外貌受体)。这种双特异性分子被明确设计为与两个靶点同时相互作用，以发挥其预期的药理活性。然而，双特异性分子和检测试剂在检测情况中可能有差别的相互作用，换句话说，在塑料容器外貌可能体现出差别的相互作用。因此，应该理解和谨慎的处理空间位阻效应。例如，从位阻效应研究中收集的数据，例如，在Octet平台上考查域结合滋扰（domain binding interferences）的数据，可能指向选择一个特定的捕获和检测顺序，以制止不须要的空间位阻效应;


     一些双特异性分子，通过协同作用，具有很高的药效学效力（highly pharmacologically potent），这可能意味着只需要很是低的临床剂量。因此, 基于已知的剂量-响应数据和剂量模型（dose modelling）的剖析要领灵敏度将会是一个重要的考量指标;


     与古板的单特异性抗体相比，双特异性分子更有可能泛起体内生物转化（biotransformation），即体内不稳定性（in vivo instability）。生物转化不但可能影响双特异性分子的活性，并且还可能影响定量双特异性分子的可靠性。因此，完全中和性，anti-idiotypic抗体或靶标分子(图3A)有可能允许检测潜在的生物转化（consequential biotransformation）;

    图3. 用于定量双特异性分子的差别测试花样和试剂。(A)完整分子的测定要领：使用靶标卵白X和靶标卵白Y作为检测试剂，测定完整双特异性分子的浓度。(B) 功效域剖析：接纳抗Fc抗体和靶标Y卵白作为检测试剂来丈量功效域Y的浓度。(C)功效域剖析：接纳抗Fc抗体和X靶标卵白作为检测试剂来丈量功效域X的浓度。(D)总浓度测定要领：通过使用两种抗Fc抗体作为测试试剂来测定双特异性分子的所有可溶形式。

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    与单特异性生物药分子类似，如通例的单克隆抗体，ADA可以通过阻断捕获或检测试剂与药物的结合来滋扰对双特异性分子的定量(注意不要与改变的药物清除率相混淆)。别的，一个结构域可能是immunodominant；那么取决于测试花样，这可能会导致PK剖析结果的差别。另外，也许除了内源性的IgG4分子之外，双特异性分子所固有的新颖，非天然结构，可能使双特异性分子比单特异性分子更容易诱发ADA反应，这是免疫原性危害评估的一个考虑因素。


功效域剖析（functional domain assay）


     功效域剖析是测定一个功效域的浓度，此花样可用于展示相关的简单功效域的浓度。当双特异性的MOA使得药物分子的一部分（a partial molecule）保存部分活性时(如可溶性靶标，融合卵白，或肽激动剂)，这些检测显得尤为重要。功效域剖析的目的是确定哪个功效域是有活性的，因此，可用于解释与ADA的形成或生物转化相关的功效丧失。


     单域测试花样的设计如图3B和3C所示。该要领特意使用药物靶标，或抑制性anti-idiotypic抗体来剖析双特异性分子的游离结构域（free domain）， 并与抗Fc或抗框架（anti-framework）抗体，作为捕获或检测试剂，联用。这些剖析要领可用于药物开发的任何阶段。有时，基于细胞的测试要领可以用于丈量单个功效域，如blinatumomab情况。


     图3. 用于定量双特异性分子的差别测试花样和试剂。(A)完整分子的测定要领：使用靶标卵白X和靶标卵白Y作为检测试剂，测定完整双特异性分子的浓度。(B) 功效域剖析：接纳抗Fc抗体和靶标Y卵白作为检测试剂来丈量功效域Y的浓度。(C)功效域剖析：接纳抗Fc抗体和X靶标卵白作为检测试剂来丈量功效域X的浓度。(D)总浓度测定要领：通过使用两种抗Fc抗体作为测试试剂来测定双特异性分子的所有可溶形式。

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总浓度剖析要领（total assay）

 
     总体测定法（total assay）用于测定双特异性分子的所有可溶形式。这种测试花样可用于显示双特异性分子的保存，而不考虑任何结构或功效的变革。该剖析要领通常用于测定卵白质的主（骨）干（backbone）结构，如Fc结构域。但这可能并不适用于所有的结构；取决于结构的性质，也纷歧定适用于所有的分子变构体，例如，在临床研究中rhuMab双特异性药物。总体测定法应当耐受ADA和与靶标的结合（target binding）。图3D描述了总体测定法，其中两个与差别表位结合的抗人Fc抗体可以用作捕获和检测试剂。


 
    图3. 用于定量双特异性分子的差别测试花样和试剂。(A)完整分子的测定要领：使用靶标卵白X和靶标卵白Y作为检测试剂，测定完整双特异性分子的浓度。(B) 功效域剖析：接纳抗Fc抗体和靶标Y卵白作为检测试剂来丈量功效域Y的浓度。(C)功效域剖析：接纳抗Fc抗体和X靶标卵白作为检测试剂来丈量功效域X的浓度。(D)总浓度测定要领：通过使用两种抗Fc抗体作为测试试剂来测定双特异性分子的所有可溶形式。

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    同样，简单多克隆抗人IgG试剂也可用作捕获和检测试剂。但此要领只用于非临床研究。关于丈量总体药物浓度， LC-MS很是有用，特别是当没有特定的试剂可用时。总体测定法可与“完整intact”或“有效active”药物测定法，结合使用，或同时使用两者，以评估体内外（in vivo /ex vivo）的稳定性，以及生物转化（biotransformation）对结构-功效关系的影响，例如，某些deamidation或氧化反应可能破坏药物与靶标的结合。

 
   PK样本中生物情况的庞大性为使用哪一种定量要领增加了另一层挑战。生物剖析要领的应用是从药物发明和临床前宁静性评估期间的动物研究开始的，连续惠临床开发，并延伸到上市后的生命周期治理(即附加适应症和/或组合疗法)。正如前面所指出的，差别的剖析战略可以在差别的开发阶段使用；当体内结构-功效关系确立之后，可以在药物发明和开发的整个历程中开发和使用简单的定量剖析要领。可是，需要对剖析要领的生命周期治理有特殊考虑，以便将来自多个物种和差别目标患者群体的PK/PD知识整合到所探索适应症中去。

双特异性分子的要领验证和认证（method validation & qualification）


    对双特异性分子的要领验证和认证与其他大分子一样，包括精密度和准确度，稀释线性度，选择性，滋扰和特异性，以及稳定性测试，以确保数据的稳健性和完整性。然而，由于双特异性分子的性质，如上所述，在开发完整分子的剖析要领时，对这两个结构域的特异性和剖析滋扰的评估都是须要的。

特别声明

    本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经宣布学术期刊, 官方网络报道, 等果真渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备�＝哟琳咛峁┯屑壑档奈南准捌淦拦�。

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